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• 필요한 것

DNA 복제 또는 재조합 DNA 기술은 관심 유전자 (표적 유전자)가 분리되고 플라스미드 박테리아와 같은 자체 복제 유기체로 옮겨지는 분자 생물학 도구입니다. 박테리아 플라스미드의 유전 암호는 과학적 목적을 위해 조작되고 분석 될 수있는 충분한 양으로 원하는 유전자의 복제물을 복제하고 생성 할 것이다. 유전자 클로닝은 표적 유전자의 말단에서 DNA를 절단하는 플라스미드 및 제한 효소를 사용하거나 "중합 효소 연쇄 반응 (PCR)"테스트를 수행하여 수행 할 수있다. 폴리 메라 이제 연쇄 반응 ').

지침

PCR 클로닝은 요구되는 유전자를 함유 한 박테리아 배양 물의 성장을 포함 할 수있다 (Fotolia.com에서 ggw로 박테리아 식민지 이미지)

1. PCR 기술과 복제 프로토콜을 연구하고 익히십시오. 분자 생물학의 과학적 환경에서 이미 알고있는 많은 정보가 있습니다. 복제에 성공하려면 이해해야 할 필요가 있습니다. 많은 프로토콜과 클로닝 키트는 Qiagen, Invitrogen, Promega, Applied Biosystems 등의 회사에서 상업적으로 구입할 수 있습니다. 그러므로 복제에 필요한 것을 결정하고 적절한 자료와 자원을 선택하십시오.

2. 관심있는 유전자에 대해 PCR 반응을 수행하십시오. PCR 프로세스는 가열 및 냉각 사이클을 포함하여 이중 가닥 DNA를 변성시키고, 관심 유전자의 말단을 표지하고 새로운 상보 적 가닥을 작제하기위한 프라이머 (primer) 라 불리는 작은 DNA 단편의 하이브리드 화 (또는 어닐링)를 포함한다 DNA 중합 효소라고 불리는 효소를 이용하여 이 단계는 40 ~ 50 번 반복하여 각주기마다 DNA를 증폭시켜 수천 개의 표적 유전자를 복제합니다. 당신은 증폭하고자하는 코드의 시작 부분과 원하는 부분 사이에 무작위적인 연결이 있다는 것을 적절한 프라이머를 사용하도록 유전자 서열을 알아야합니다.예를 들어 특정 DNA 중합 효소에 대한 필요성이있을 수있는 복제 방법에 따라 특정 유전자의 완결 (평활 말단) 또는 TA 복제 (절단을 용이하게하기 위해 고안된 상보적인 티민과의 연결 포함)가 갑자기 중단 될 수 있습니다 Taq polymerase는 고온에서 합리적으로 열 안정성을 가지지 만 뉴클레오티드 정정 능력을 갖지 않으므로 새로운 DNA 가닥을 만드는 과정에서 DNA를 순차적으로 증폭시켜 응집성을 유지합니다 증폭.

   
   

3. 원하는 경우 증폭 된 유전자를 PCR에서 정제해야합니다. 이 단계는 여러 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다. 한 가지 가능한 방법은 잔류 프라이머 또는 효소를 제거하기 위해 스피닝 컬럼을 거쳐 필터링하는 것입니다. 대안으로, 전기 영동을 수행하여 수득 된 DNA 밴드를 분리, 절단 및 세척 할 수있다.

4. 정제 된 유전자를 연결하고 적절한 PCR 플라즈미드 벡터로 증폭시킨다. 상업적으로 구입 한 키트에는 pGEM 또는 pCR2.1과 같은 표준 플라스미드 벡터가 제공됩니다. 증폭 된 DNA, 결합 완충액, 플라스미드 및 DNA 리가 아제 효소의 필요한 양에 대한 제조업체의 키트 또는 권장 사항에 따라 바인딩 반응을 설정하십시오. 결합 반응은 원형 플라스미드가 그의 유전자를 플라스미드 게놈에 도입시키는 것을 허용 할 것이다.

5. 플라스미드 벡터 (유전자를 포함 함)를 대장균을 사용하여 박테리아 세포에 삽입하는 형질 전환 반응을 수행하십시오. 이 단계를 준비하기 전에 며칠 동안 한천 플레이트를 만들고 배양기에 플레이트를 보관하십시오. 시약 볼륨을 추가하고 사용중인 프로토콜에 언급 된 부화 시간을 사용하여 플라스미드를 세포와 매우 조심스럽게 결합하십시오. 한천 플레이트에 박테리아 세포를 퍼 뜨리고 37도에서 배양하고 밤새도록 두십시오.

6. 한천 플레이트에 파란색과 흰색 박테리아의 식민지에 대한 메모가 있습니다. 삽입 유전자를 포함하는 콜로니는 파란색이 아닌 흰색이됩니다. 여러 개의 백색 식민지를 선택하고 암피실린과 함께 lysogenic broth (LB)로 배지에서 배양하여 복제 된 유전자 삽입물로 많은 양의 박테리아를 얻습니다. 이 단계가 끝나면 증폭되고 암호화 된 유전자를 제공하게됩니다. 복제 된 유전자의 스크리닝을 수행하려면 시판중인 키트를 사용하여 박테리아 플라스미드 DNA를 분리하고 유전자를 정제하십시오. 필요할 때까지 냉동실에 보관하십시오.

   
   

필요한 것

• 상업적으로 이용 가능한 클로닝 키트
• PCR 시약
• Thermocycler (또는 PCR 기계 / PCR 기계)
• 인큐베이터
• 실험실 장비 및 소모품
• 복제를위한 표적 유전자